主条目：南京市 (中華民國)
1921年中华民国临时大总统孙中山办公室
《国都界线图》，1929年
原国民大会堂，建成于1936年
1937年南京大屠殺中，日軍強硬將中國平民押進坑中準備集體活埋。
1911年(宣統三年)辛亥革命爆發，1912年1月1日（民国元年）孫中山在南京宣佈成立中华民国，出任臨時大總統，以南京為中華民國首都。2月溥儀在北京宣佈退位，孫中山在南京辭去臨時大總統一職，由袁世凱繼任，為防止袁世凱闊權，孫中山頒布中華民國臨時約法以為規範。同年，改江宁府为南京府。
北洋軍閥混戰期間，南京曾為軍閥孫傳芳的大本營，成為號令華東諸省的中心，1926年冬，北伐的國民革命軍擊敗孫傳芳部隊，取回南京。1927年（民国16年），中华民国奠都南京，同年置南京特別市。1929年（民国18年）6月1日，安葬孫中山於南京中山陵，置首都特別市。1930年（民国19年）更改為院轄市（直轄市）。1931年(民国20年)，六月一日公布《中华民国训政时期约法》，其中第五条明定“中华民国国都定于南京”，確定南京在法律上做為中國首都的地位。1929年－1937年间，南京进行了大规模的首都建设，基本形成了近代南京的城市格局。
1929年（民國18年），國民政府為了迎接由北京至南京奉安的孫中山靈柩，趁勢在南京進行建設，包括在長江口修建新碼頭(中山碼頭)，並將移靈經過的道路進行拓寬與鋪設柏油，形成今天的中山北路、中山路、中山东路，並大量種植法國梧桐樹綠化市容。此后直到1937年的数年间，南京陆续建成中正路（中山南路）、太平路、白下路、汉中路、中华路、雨花路、山西路、国府路、热河路、珠江路、莫愁路、昇州路、上海路、广州路、以及颐和路一带住宅区道路，形成了南京的近代干道系统。
1937年（民国26年）7月7日抗日战争全面爆發，8月13日淞滬會戰展開，日軍開始對南京進行大規模的空襲轟炸，市容與城市建設受到嚴重破壞，11月国民政府遷都至重庆，12月8日日軍進犯南京城，由於指揮官唐生智臨陣脫逃，中國軍隊在南京的防禦潰散，12月12日南京沦陷。12月13日開始後的大約六個星期時間，入侵的日本军队在南京进行了大屠杀，至少30万人遇难。南京淪陷後，侵華日軍將南京做為扶植漢奸傀儡政權的根據地，1940年(民國29年)汪精衛在南京成立「中華民國國民政府」，替日本人統治大前方的淪陷區。
1945年(民國34年)8月15日日本投降，中國抗戰勝利，不久之後國民政府收復南京。1946年（民国35年）5月5日，中华民国国民政府还都南京。由於不久之後国共内战全面爆发，國府已無充足的財政在这一时期的南京大规模的建设活动，南京不復抗戰前的盛況榮景。
同年11月，中華民國制憲國民大會在南京的國民大會堂(今人民大會堂)召開。原本憲法草案定國都為南京，但審查會及第一讀會決定改為北平。經大會主席團代表蔣中正出面說明，主張國都地點，不必定於憲法，始將第一讀會通過的「國都定於北平」一條予以刪除[9]。12月25日中華民國憲法三讀通過，1947年(民國36年)1月1日公佈，同年12月25日正式實行。自此，南京失去中華民國法定國都的地位。
1947年11月21日至23日依憲法規定舉行第一屆中華民國國民大會代表選舉，1948年1月21日至23日則舉行第一屆中華民國立法委員選舉。1948年3月29日於南京報到召開行憲後的國民大會，4月在南京選舉出蔣中正為第一屆中華民國總統，李宗仁為第一屆中華民國副總統，5月20日在南京總統府舉行就職典禮。1月間選出的立法委員則於5月8日自行集會於南京國民大會堂，並於5月18日正式開議。
1948年(民國37年)底，國共內戰情況對國民黨趨於不利的態勢，1949年1月國府行政院及各單位開始遷往廣州，僅總統府仍在南京。1月26日，中共政权攻占长江北岸的六合县县城（当时六合县属江苏省第五行政督察区，不属南京特别市）。4月21日，中国人民解放军发起渡江战役，渡過長江。4月23日，解放军攻陷南京城，24日凌晨，解放军第35军攻占南京总统府。国民政府南迁广州，後又遷重慶、成都最後迁抵台北。