二、菌种鉴定的方法
1，传统方法
基于菌落形态和细菌生理生化特性的菌种鉴定，包括以下指标或方法：
菌落形态学：菌落颜色、形状、大小和产色素；
细胞形态学：细胞大小、细胞形状、鞭毛类型、内容物、革兰氏染色、芽孢和抗酸染色、孢子形成模式；
生理学：氧气耐受性、pH范围、最适温度和范围、耐盐性；
生化特征：氮源的利用、碳源的利用、碳水化合物的氧化或发酵、酶的模式；
抑制性：胆盐耐受性、抗生素敏感性、染料耐受性；
血清学：凝集反应、荧光抗体；
化学分类：脂肪酸构成、微生物毒素、全细胞组分；
生态学：微生物来源；
基于检测以上指标的传统的菌种鉴定方法，包括Biolog微生物鉴定系统（代谢指纹），API菌种鉴定系统、Sherlock MIS 微生物菌种鉴定系统等，本质上是基于表型的菌种分类，这些基于形态学和理化指标的传统方法，优点是方法简单，历史悠久，可获得菌培养的一些经验和数据积累。但缺点也很明显：周期长，尤其生长慢的菌种；不足够客观和数据化；能准确鉴定的菌种数量有限，对于背景资料了解不多的菌种，有可能力不从心；正迅速地被新技术边缘化从而成为辅助性的检测分型手段；
2，分子生物学方法（其中，DNA测序或基因测序是菌种鉴定主流方法）
鉴于前述微生物研究的重要性和菌种鉴定在微生物研究的重要性，能用于菌种鉴定的方法和技术随着分子生物学技术的进展都得到了应用。分子生物学方法进行菌株鉴定，本质上是基于对菌株基因的检测从而实现菌株的分型。所用的技术手段包括：分子杂交，RFLP、RAPD、SSCP，PFGE，基因芯片，q-PCR，基因测序等。
受益于技术的进步及大规模应用带来的成本下降， DNA测序（基因测序）目前成为菌株鉴定的主流技术之一（另外一个主流及有未来的技术是基于质谱的菌种鉴定）及金标准。测序得到的序列数据，是菌株鉴定最底层因而也是最可靠和最核心的数据，基于基因序列而绘制的分子进化树及和其它种属微生物亲缘关系远近的分析，也能比其它菌种鉴定方法提供更多且有用的信息。
应用于菌种鉴定的DNA测序，也分为 部分基因测序，如16s RNA（真核微生物用18s rDNA或ITS区域测序）基因测序，和 全基因测序两种。
rDNA既有相对保守区，也有突变频率较高的可变区，结合PCR技术及Sanger测序或NGS测序得到这部分序列信息，进而进行对库比较，可以鉴定菌种到属种。这种方法费用较低，速度快（1-2天），结果准确可靠。
如果要鉴定菌株，或者对多次传代后的重要菌种进行质量鉴定，则需要对菌株全基因组进行测序，并对测序结果进行生物信息学分析。这种方法信息全，数据多（可用于其它分析），费用略高，周期略长（1-3周，根据基因组大小、测序深度要求及数据分析要求而定）。
3，基于质谱的菌种鉴定方法
微生物的质谱鉴定是一种基于细菌全细胞蛋白质组指纹图谱分析的技术，需要通过专门的数据库和自动分析系统对未知细菌的特殊蛋白图谱与菌种文库中收集的菌种蛋白质组指纹图谱进行比较。由于微生物质谱分析的蛋白质大分子适合于飞行时间质量分析器，因此，微生物的质谱鉴定被统称为基质辅助激光解吸电离的飞行时间质谱技术（MALDI-TOF MS）。 参考资料：中华人民共和国国家标准 GB/T 33682--2017 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴别微生物方法通则
质谱鉴别微生物，具备 快速， 高通量， 操作简单， 结果重复性好等特点，在临床感染微生物诊断中有重要的意义，也发展很快。国内体外诊断厂商也有好几家在这一领域发力，推出了一些基于质谱的微生物鉴定系统。
三、rDNA测序与菌种鉴定
1，细菌
细菌鉴定的靶标是 16S 核糖体 RNA (rRNA) 基因序列。16s rRNA为核糖体的RNA的一个亚基，16s rDNA就是编码该亚基的基因。
细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5s、16s和23s rRNA。16s rDNA是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因中。
16s rDNA是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟，素有“细菌化石”之称。具备以下特征：
（1）普遍存在；16S rRNA 普遍存在，因此可用于研究所有细菌之间的系统发育关系；
（2）大小适中约1.5Kb, 利用测序技术较容易得到序列数据；
（3）在大多数原核生物中rDNA都具有多个拷贝，易于扩增；
（4）在基因结构与功能上具有保守性，结构上又包含有9个可变区（variable region，V1-9）可以体现不同种属的差异，也包含10个保守区（constant region）给扩增引物设计及数据分析带来极大的便利。
因为上述特点，16s rDNA是细菌种属鉴定的理想靶标。研究者可以根据课题情况，选择对16S rDNA基因的前 500 bp或完整的约1,500 bp长度测序。前500 bp涵盖16S基因9个高变区中的3个，能够满足常规鉴定需求。
在某些情况下，500 bp区域不足以区分非常密切相关的细菌，因此需要信息量更大的16s rDNA全基因读取。另外，在描述新物种时，需要对整个 1,500 bp 序列进行测序。
16S rRNA基因中的高变区。细菌16S基因内有9个高变区，以红色表示。保守区域用蓝色表示。
以上图表为16s rDNA常用引物（待核实推敲），根据实验需要选择组合；也可以根据16s rDNA保守区域序列自行设计。
8对原核生物16S rRNA基因扩增引物及其相对位置
8对16S rRNA基因扩增引物
古菌16S rRNA 基因扩增引物选择方案
2，真菌和酵母菌
真核微生物，与原核生物16s rDNA同源的为18s rDNA，18s rDNA同样包含保守区和可变区（V1-V9，没有V6区），18s rDNA是编码真核生物核糖体小亚基的DNA序列，适用于种级及以上的分类标准，也是真核微生物基于测序方法进行种属鉴定常用的靶标区域。其中，V4区使用最多、数据库信息最全、分类效果最好，是18s rRNA基因分析注释的首选选择。由于18s rDNA在进化速率上比较保守，因此在系统发育研究中较适用于种级以上阶元的分类。内转录间隔区ITS位于核糖体rDNA 18S、5.8S及28S之间，由于承受的选择压力小，在进化过程中能够承受更多的变异，其进化速率为18s rDNA的10倍，属于中度保守的区域，利用它可研究种及种以下的分类阶元。另外，也可通过选择引物同时扩增18s rDNA和ITS，通过分析18s rDNA序列，先在较高级别上确定样品的归属，然后根据ITS 序列，将真菌归类到种或亚种水平。
对于真核微生物物种鉴定，基于测序的方法，常选择18s rDNA + ITS区域作为基因组的靶区域进行序列数据获取和分析，从而得到更精准的物种分类信息。
ITS 1和ITS 2长度分别为350 bp和400 bp。
真核微生物核糖体DNA结构示意图
ITS基因通用引物表
18S rRNA基因通用引物表
四、全基因组测序与菌种鉴定
对菌落用NGS平台进行全基因组测序，是菌种鉴定的终极解决方案。可以鉴定到菌株。此外，全基因组信息，还可以通过生信分析，得到更多的信息，比如GO、Pathway等。对于有潜在重要价值的菌株，全基因组序列数据基本上也是必备数据之一，是对微生物进行基础研究的重要手段之一。
rDNA测序，不一定能够鉴定到种。确定到株，更是说服力不强。
附带提一下，宏基因组测序，可以得到群落中的大部分菌株的基因组信息（丰度太低则有可能得不到信息）。如果要得到菌株信息，还需要进行分离培养再做全基因组测序。
五、菌种鉴定与数据库及生物信息学
无论用哪种方法进行菌种鉴定，数据库的容量和质量，都是非常重要的方面，甚至可以决定一个方法是否具有生命力。
当然，方法的生命力和数据库的容量和质量，是相辅相成的两个方面。一个菌种鉴定方法可靠易用，那么用的人就多，相应的数据库的容量和质量就有基础，并对方法的应用起到重要的支撑作用。
1，genebank
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
目前应用最广的分子生物学数据库，是NCBI的genebank，无论是rDNA，还是全基因组测序的结果，基本上首选是对NCBI数据库进行比较和分析。这是美国占领生物技术高地的基础设施的一部分，且地位日益稳固。
2，EzBioCloud Database
https://www.ezbiocloud.net/
EzBioCloud由隔壁韩国CJ Bioscience公司建立和维护，是保持数据库更新的公共数据分析的门户网站，专注于细菌和古菌的分类学，生态学，基因组学，宏基因组学和微生物组。包括生物信息学工具，并继承了以前的数据库，包括EzTaxon, EzTaxon-e和EzGenome。EzBioCloud网络已在50多个不同的国家被超过22,000名用户使用，包括学术界，非营利研究组织，医学界，政府机构和全球公司。
3，每个推出相应菌种鉴定方法的公司，都会自己建立相应的数据库（没有数据库支撑就没有用户买设备和试剂）。质谱领域基本是这个模式。
近年来，我国对于微生物资源重视程度也在日益增加，国家菌种资源库（以下简称菌种库）以原国家科委指定相关部委设立的国家级专业菌种保藏中心为基础，2002年开始组建，2011年成为科技部、财政部首批认定的23家国家科技基础条件平台之一，2019年优化调整定名。
很遗憾，好像没有菌种公共数据库。
希望国内有机构持之以恒的建设高质量和广泛接受度的微生物乃至全物种基因数据库。这是现代生物学重要的基础设施之一。
另外，生物信息学分析，在现代生物技术包括菌种鉴定技术中，也发挥着越来越重要的作用。干湿结合是方向和必需，干实验，湿实验同等重要，互相补充。
六、结语
微生物研究与检测在生产生活及疾病诊疗方面发挥着越来越重要的作用，且未知微生物种类及研究价值也潜力巨大，菌种鉴定技术应用会越来越广泛。笔者认为，在科研领域，基于测序的菌种鉴定方法会是主流，而临床诊断类的应用，基于质谱的菌种鉴定会更适合临床需求。
奥科生物具备成熟的Sanger测序，NGS测序及生信分析平台，在基于测序的菌种鉴定及数据分析方向有较强的技术实力及非常丰富的技术服务经验，可以为生命科学研究和开发工作者提供通用或个性化的专业技术服务。
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